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ELISA试剂盒灵敏度偏低、重复性较差问题的探讨
  • 发布日期:2019-11-15      浏览次数:54
    •    ELISA试剂盒的使用非常便捷这是众所公认的,但同时也有一些特殊因素时刻影响试验的正常结果。较为常出现的问题是显色淡,灵敏度偏低、重复性不佳、假阳性结果和假阴性结果,不管出现什么样的结果,不但浪费客户的金钱、样本、精力,更重要的是对临床做出了危险判断。
        一、显色淡,灵敏度偏低
        1.试剂盒在运输途中时间太长,温度太高;所以尽量缩短运输时间,夏季应放冰块降温。
        2.培养箱温度不足37℃,应注意培养箱温度,放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定,非隔水式培养箱尤其应注意。
        3.试剂盒未充分平衡;所以试剂盒从2~8℃冰箱取出后打开盒盖,于室温平衡至少20分钟,确保所有试剂已平衡至室温(约25℃)。
        4.保温时间不足;所以做实验时一定注意时间的重要性,如果怕忘了时间,可以校正定时钟准确定时。
        5.洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加;按说明书要求保留洗涤时间,准确记住洗涤次数。
        6.移液器吸液量不足,吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁;所以保证校正移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密,吸嘴内壁要清洁,一次性使用。
        7.蒸馏水水质有问题,要使用新鲜合格的蒸馏水。
        二、假阳性结果和假阴性结果
        1、标本的采集与保存
          1)当标本采集保存不当产生溶血时,红细胞中的血红蛋白释放到血清中,血红蛋白具有过氧化物酶的性质,其通过吸附或“PP效应”(蛋白质间相互吸附的现象)结合后,可催化A、B液显色而造成假阳性
          2)反复冻融血清会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存做多次检测,宜少量分装冻存。
          3)标本采集保存不当致细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,会产生假阳性反应;标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合,易使间接法的试验本底加深。因此,标本宜在新鲜时检测。
        2.加样
          1)如果样品稀释液少加或血清多加,都会引起本底增高。对于间接法来说,受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强,非特异性IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异性的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多,高于规定的稀释倍数,极易造成高值阴性。反之,造成假阴性。
          2)如果加入的酶结合物过多或加在较高的孔壁上或孔口,也会引起本底升高或假阳性。
          3)如果血液未开始凝固或凝固不完全时就强行离心分离血清,此时的血清中仍留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果。
        3.温育
          1)由于ELISA试验在一定温度下的反应时间并不是反应的终点,温育时间过短、温度过低,易致显色不全;温育时间过长、温度过高,易致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底,产生阴性高值或假阳性反应。因此,要严格按规定的温度和温育时间进行。
          2)由于水浴较难将温度控制在稳定的范围,因此我们每次试验时应认真观察水浴箱的温度,尽量少开启水浴箱门,严格控制水浴的温度为37±0.5。同时,微孔板不可重叠放置,以保证传热均匀,各板的温度都能迅速达到平衡。
          3)由于试剂盒通常设定的反应温度为37度,在这个温度下温育一定时间,蒸发的水分会很多,对于整个反应体系来讲,各种反应物的浓度会不断地增加,这样必会导致反应*后的值升高。因此温育时应贴上封板胶。
        4.洗板
        洗板在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却是决定试验成败的关键。ELISA就是靠洗板来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的,通过洗板以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗板时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在ELISA操作中,洗涤是*主要的关键技术,应严格按要求洗涤。洗板如不彻底,有酶结合物的非特异性吸附,将使空白值升高。另外,在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净,也将与酶标记抗体作用而产生干扰。
          1)各厂家的洗液是根据各自试剂的条件配制的,因此采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果,包括本底升高,所以不同厂家的洗液不应混用。
          2)洗液应按规定的倍数稀释使用。试剂盒提供的洗液是浓缩的,过多稀释洗液,会影响洗液的效果,而使反应的本底升高。反之造成假阴性。
          3)稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水,电导率小于1.5us/cm。如果水中含有过多的钙、镁离子,这些离子会占用表面活性剂,使试验本底增高。
        三、重复性较差,经常有客户反馈说做了两个复孔值相差太大。可能的问题有:
          1.保温时间不一致,洗涤条件不一致,操作人员不一致;重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性。
          2.样品数量多少不一,加样时间有长有短;所以重复某一样品时,加样时间尽可能接近。
          3.加样量不一致;样品稀释前应充分混匀,尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。
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