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大鼠αL岩藻糖苷酶(AFU)ELISA试剂盒课题专用
  • 发布日期:2020-01-16      浏览次数:68
    • 大鼠αL岩藻糖苷酶(AFU)ELISA试剂盒课题专用

      大鼠αL岩藻糖苷酶(AFU)ELISA试剂盒实验原理

      大鼠αL岩藻糖苷酶(AFU)试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包大鼠αL岩藻糖苷酶(AFU)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠αL岩藻糖苷酶(AFU)正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

      样本处理及要求

      1。  血清将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4过夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20或-80保存,但应避免反复冻融。
      2.  血浆用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20或-80保存,但应避免反复冻融。
      3.  组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。

      4.  细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

      注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

      需要而未提供的试剂盒器材

      1。酶标仪(450nm)

      2.高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

      3.37℃恒温箱

      4。蒸馏水或去离子水

      大鼠αL岩藻糖苷酶(AFU)ELISA试剂盒组成

       

      名称

      96孔配置

      48孔配置

      备注

      微孔酶标板

      8孔×12

      8孔×6

      标准品

      0.3mL*6管

      0.3mL*6管

      样本稀释液

      6mL

      3mL

      检测抗体-HRP

      10mL

      5mL

      20×洗涤缓冲液

      25mL

      15mL

      按说明书进行稀释

      底物A

      6mL

      3mL

      底物B

      6mL

      3mL

      终止液

      6mL

      3mL

      封板膜

      2张

      2张

      说明书

      1份

      1份

      自封袋

      1个

      1个

      1。  标准品浓度依次为:48、24、12、6、3、1。5 U/L

      2.  经过大量正常标本检验,标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内,实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时,可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

       

      注意事项

      1、严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

      2、洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

      3、消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。

      4、底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。

      5、避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

      6、在储存和温育时避免强光直接照射。

      7、平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

      8、任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

      9、不能使用过期产品。

      10、如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置

      试剂准备

      试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

      20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

      操作步骤

      1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

      2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

      3.样本孔待测样本50μL;空白孔不加。

      4。 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

      5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

      6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

      7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

      实验结果计算

      所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程将样品的OD值代入方程,计算出样品浓度

      试剂盒性能

      1、检测范围1.5 U/L  48 U/L

      2、灵敏度:最低检测浓度小于0。1 U/L

      3、特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

      4、重复性:板内变异系数小于10% ,板间变异系数小于15% 。

       

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